引言

作為世界上最小的細菌之一，支原體能夠獨立繁殖。它們屬于柔膜菌綱，生長非常緩慢，且為寄生。細胞培養物的污染仍是一個主要問題。一系列生理和生化參數受細胞培養物中支原體的影響。支原體感染會導致細胞的代謝、生長、活力、大分子合成、形態等發生變化，因此對細胞培養物進行靈敏的常規污染檢測是必不可少的。

傳統的基于生長的方法需要培養至少28天才能確定地排除支原體污染。相比之下，核酸擴增技術（NAT）可將獲得結果的時間縮短到幾個小時。作為培養法的一種替代方法，必須證明NAT測試系統能夠檢測10 CFU/mL的支原體。為此，本研究中對三種不同的支原體PCR試劑盒進行了測試，測試其在DMEM培養基中檢測不高于10 CFU/ml支原體的能力。

實驗設置和結果

在本次研究中，使用Microsart^® AMP支原體試劑盒（包括樣品制備）和Microsart^® AMP提取試劑盒（Sartorius Stedim Biotech GmbH）和其他兩種支原體檢測試劑盒進行了驗證測試，這兩種檢測試劑盒也基于DNA分離和隨后的實時熒光定量PCR分析。使用10CFU靈敏度標準精氨酸支原體（NCTC編號10129）、口腔支原體（NCTC編號10112）和柑橘螺原體（NCTC編號10164）（Sartorius Stedim Biotech GmbH）作為測試材料。這些凍干標準品可以通過加入1 ml樣品基質輕松再水化，達到10 CFU/ml的濃度。這些制劑旨在用于安全可靠地對支原體PCR分析進行驗證。在這些比較研究中，使用含有5% FCS的DMEM培養基作為樣品基質。

對于全部三種測定，根據制造商的手冊進行DNA分離過程和隨后的PCR設定。Microsart^® AMP提取試劑盒基于方便的二氧化硅柱方案，可在30分鐘內完成。競爭產品的DNA分離基于磁珠法使DNA沉淀。在評估的三種PCR檢測方法中，兩種包括高度特異性的TaqMan探針；其中之一是Microsart^® AMP支原體檢測試劑盒。第三種檢測方法的檢測混合物中含有SYBR Green，使得在DNA擴增循環后需要進行融解曲線分析，以區分非特異性擴增DNA和支原體擴增DNA。

每種樣品（精氨酸支原體、口腔支原體和柑橘螺原體）用每種試劑盒測試四次，包括DNA分離、聚合酶鏈式反應和數據分析的全過程。結果列于表1中。

表1：使用三家不同供應商的試劑盒對DMEM培養基 + 5% FCS和10 CFU/ml 精氨酸支原體|口腔支原體|柑橘螺原體進行PCR測試的結果

圖 1：使用Microsart^® AMP支原體試劑盒的擴增曲線，使用精氨酸支原體樣品（10 CFU/ml，在DMEM培養基 + 5% FCS中），PCR Cycler MxPro 3005P

結論

在這些研究中，使用包括另外兩家供應商支原體實時熒光定量PCR試劑盒（包括樣品制備）對賽多利斯 Microsart^® AMP提取試劑盒和Microsart^® AMP支原體試劑盒進行了驗證測試。

在隨后的PCR分析中，36個DNA提取物均顯示陽性信號。因此說明所有測試產品都能以至少10 CFU/ml的靈敏度檢測支原體污染。

如果仔細觀察一家供應商的結果中的標準偏差，首先使用Microsart^® AMP提取試劑盒，然后用Microsart^® AMP支原體試劑盒進行擴增，則會盡可能地減小結果的可變性，提高重現性。PCR試劑盒，主要是三種不同的樣品制備方法可能導致出現重現性差異。已知二氧化硅膜方法即使在處理高度復雜的樣品基質時也非常穩健和可靠。DNA沉淀法或磁珠法往往更費力且不可靠。

另一個有助于Microsart^®支原體產品適用范圍可靠性的事實是，所有PCR試劑都可以儲存于4至8°C條件下。因此，如果冷鏈短暫中斷，不會導致試劑發生融化，否則會對PCR檢測的靈敏度產生負面影響。相反，供應商T和供應商R的支原體檢測試劑盒必須在-20°C冷凍保存。當計劃用這些產品進行測試時，必須記住PCR試劑解凍的額外等待時間。此外，必須考慮如果必須在-20°C儲存的試劑盒在一次PCR運行中未完全用完，反復凍融也會對PCR結果產生負面影響。

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